Мушиный гриб-паразит делает из самцов домашних мух некрофилов

Чтобы обеспечить свое распространение, многие паразиты манипулируют поведением инфицированных хозяев. Но энтомопатогенный гриб энтомофтора мушиная (Entomophthora muscae) пошел дальше: он управляет не только зараженной комнатной мухой (Musca domestica), но и поведением ее здоровых конспецификов. Трупы самок мух, погибших из-за E. muscae, привлекают здоровых самцов этого вида, которые заражаются патогенным грибом в результате попыток спариться с мертвыми самками. Механизм, лежащий в основе привлечения здоровых мух зараженными трупами, оставался неясным, однако недавнее исследование позволило пролить свет на эту загадку. Вероятно, энтомофтора синтезирует химическую смесь летучих сесквитерпенов и меняет уровень кутикулярных углеводородов в мертвых инфицированных трупах мух. Эти вещества вызывают у здоровых самцов комнатных мух половое влечение, что и приводит к попыткам спариваться с трупами и к практически неминуемому заражению грибом.

Облигатные паразиты, независимо от их таксономической принадлежности, испытывают острую потребность в хозяине, поэтому эволюция паразитизма — это долгая и изысканная история приобретения самых разнообразных способов привлечения и эффективного заражения хозяев, а также манипулирования их поведением. Находясь внутри хозяина, паразиты могут управлять его поведением, чтобы увеличить вероятность распространения своего потомства и заражения новых хозяев.

Паразитоиды также могут манипулировать поведением своих жертв, впрыскивая в их тело смертоносный химический коктейль и превращая их в покорных «зомби», которых можно использовать в качестве «живых консервов» для своих личинок. Разница между паразитами и паразитоидами в том, что вторые проводят в теле хозяина лишь часть своей жизни (на стадии личинки), постепенно поедая и в конце концов убивая его.

В последнее десятилетие появились работы, посвященные, по всей видимости, довольно распространенному в мире паразитов способу привлечения новых хозяев — с помощью летучих химических соединений, привлекательных для жертв. Например, энтомопатогенные бактерии (Erwinia carotovora carotovora, Serratia marescens и Pseudomonas entomophila) меняют социальное поведение своего хозяина, дрозофилы (Drosophila melanogaster): инфицированные мухи выделяют в окружающую среду повышенное количество феромонов (метиллаурата, метилмиристата и метилпальмитата), привлекая (и заражая!) здоровых соплеменников (I. W. Keesey et al., 2017. Pathogenic bacteria enhance dispersal through alteration of Drosophila social communication). Трупы западных кукурузных жуков (Diabrotica virgifera), погибших из-за поражения энтомопатогенными нематодами Heterorhabditis bacteriophora, выделяют летучий бутилированный гидрокситолуол, который привлекает здоровых жуков этого вида и повышает эффективность распространения нематод (X. Zhang et al., 2019. Entomopathogenic nematodes increase predation success by inducing cadaver volatiles that attract healthy herbivores). Несмотря на то, что насекомые могут распознавать и избегать контакта с грибными спорами на различных поверхностях, споры энтомопатогенного грибка Beauveria bassiana привлекают самок комаров Anopheles stephensi (J. George et al., 2013. Malaria Mosquitoes Attracted by Fatal Fungus). Вирус огуречной мозаики (cucumber mosaic virus) делает пораженное растение менее вкусным для своих основных переносчиков — тлей (Myzus persicae и Aphis gossypii), но зато инфицированное растение начинает выделяет в несколько раз больше веществ, привлекающих этих насекомых (K. E. Mauck et al., 2010. Deceptive chemical signals induced by a plant virus attract insect vectors to inferior hosts).

Энтомопатогенный гриб энтомофтора мушиная (Entomophthora muscae), паразитирующий на комнатных мухах (Musca domestica) интересен тем, что меняет поведение не только своего хозяина, но и его здоровых, еще не зараженных конспецификов. Для их привлечения E. muscae использует так называемую межвидовую сексуальную мимикрию (Interspecific deceptive mimicry): трупы самок комнатных мух, пораженных энтомофторой, привлекают здоровых самцов этого вида, которые пытаются спариваться с ними и в результате сами заражаются патогенным грибом. Несмотря на то, что впервые поражение мух энтомофторой было описано в далеком 1855 году Фердинандом Коном (F. Cohn, 1855. Empusa Muscae und die Krankheit der Stubenfliegen), механизм, лежащий в основе необычного способа распространения грибка, до сих пор остается неясным.

E. muscae вызывает эпизоотии не только среди комнатных мух, он может поражать и других двукрылых (из семейств Calliphoridae, Culicidae, Drosophilidae, Muscidae, Sarcophagidae, Scathophagidae, Syrphidae и Tachinidae; см. C. Elya, H. H. De Fine Licht, 2021. The genus Entomophthora: bringing the insect destroyers into the twenty-first century). Попав на покровы насекомого, конидии гриба прорастают сквозь кутикулу, после чего гриб проникает в гемоцель хозяина, где образует многочисленные гифы. Гифы быстро заполняют все тело насекомого, особенно разрастаясь в брюшной полости и жировом теле. Смерть мухи обычно наступает в течение 5–8 дней после заражения. Перед смертью зараженные мухи приземляются на поверхность и стремятся заползти на какое-либо возвышение, где и умирают в характерной позе с выпрямленными задними ногами и распростертыми крыльями, облегчая тем самым распространение грибных спор. Через три часа после гибели мухи конидиеносцы энтомофторы выходят на поверхность трупа между сегментами брюшка насекомого. Созревание и рассеивание конидиев происходит в течение первых суток после смерти хозяина, после чего они образуют характерный ореол на поверхности вокруг трупа.

Для заражения здоровой мухи энтомофторой, необходимо, чтобы грибные споры попали в ее организм в момент их рассеивания, или чтобы насекомое коснулось спор, лежащих рядом с трупом. В любом случае, самый эффективный способ заражения энтомофторой — это непосредственный контакт с погибшим от нее насекомым.

Спаривание комнатных мух начинается с так называемого «брачного удара» (mating strike, C. M. Murvosh et al., 1964. Studies on the Mating Behavior of the House Fly, Musca Domestica L.), когда самец прыгает на самку и располагает свои ноги у основания ее крыльев, а самка при этом мгновенно расправляет крылья горизонтально, как при полете. Очевидно, что проявление здоровым насекомым брачного поведения по отношению к инфицированному, бесспорно, очень выгодно паразиту. Но что же заставляет здоровых мух не только приближаться к зараженным и погибшим соплеменникам (соплеменницам) с явными признаками грибковой инфекции, но и пытаться спариться с ними?

Известно, что самцы комнатных мух могут различать трупы самцов и самок, пораженных E. muscae: если предложить им выбор между мертвыми мухами разного пола, они гораздо охотнее и быстрее приближаются к самкам, и уже с расстояния 1–2 см бросаются для совершения «брачного удара» (L. Zurek et al., 2002. Effect of the entomopathogenic fungus, Entomophthora muscae (Zygomycetes: Entomophthoraceae), on sex pheromone and other cuticular hydrocarbons of the house fly, Musca domestica). Не в этом ли секрет привлекательности инфицированных мух? Может быть, самцы просто реагируют на увеличенное брюшко, которое в результате поражения грибком становится еще больше? Однако эксперименты с предложением здоровым самцам разнополых трупов с брюшками одинакового размера показали, что самцы все равно в 92,3% случаев предпочитают спариваться с мертвыми самками. Да и вообще, здоровые самцы, как правило, не проявляли к трупам особого интереса, пока не приближались к ним на расстояние около семи сантиметров — то есть визуального стимула было явно недостаточно.

Но может быть, пораженные энтомофторой трупы самок привлекают внимание здоровых мух за счет выделения в окружающую среду каких-то химических веществ? Возможно, погибшие самки распространяют вокруг себя более сильный и мощный аромат феромонов? Правда, известно, что большинство кутикулярных углеводородов, к которым относятся феромоны мух, воспринимаются насекомыми только с близкого расстояния, но процесс разложения тканей может повлиять на летучесть феромонов, которые будут восприниматься насекомыми на большем расстоянии (S. Lebreton et al., 2017. A Drosophila female pheromone elicits species-specific long-range attraction via an olfactory channel with dual specificity for sex and food). Для проверки этой гипотезы в упомянутой работе L. Zurek et al. у погибших от грибковой инфекции и усыпленных здоровых мух сравнили количество кутикулярного углеводорода (Z)-9-трикозена (muscalure) — одного из основных женских феромонов комнатных мух. Однако вопреки ожиданиям исследователей, количество этих углеводородов не различалось в трупах здоровых и инфицированных взрослых самок, а в трупах молодых мух, погубленных энтомофторой, и вовсе феромонов было меньше.

Так что секрет привлекательности зараженных трупов так и остался неразгаданным, породив лишь новые вопросы вроде такого: могут ли здоровых мух привлекать какие-то другие феромоны погибших самок, помимо (Z)-9-трикозена? К тому же есть данные, что некоторые штаммы домашних мух вообще не выделяют (Z)-9-трикозен (например, N. Noorman, C. J. Otter, 2003. The effects of laboratory culturing on (Z)-9-tricosene (muscalure) quantities on female houseflies). Если причина в феромонах, то почему в трупах инфицированных самок этих гипотетических веществ больше, чем у умерших здоровыми? А может быть, энтомофтора сама производит какие-то аналоги мушиных феромонов?

Недавнее исследование ученых из Копенгагенского университета и Шведского университета сельскохозяйственных наук, опубликованное пока в виде препринта, позволило пролить свет на то, каким способом гриб манипулирует половым поведением хозяина-мухи. Андреас Наундруп Хансен (Andreas Naundrup Hansen) с коллегами попытались проверить, действительно ли E. muscae привлекает здоровых мух, меняя химический состав инфицированных трупов, и какие именно вещества манят самцов.

У исследователей было две гипотезы:
    1) E. muscae каким-то образом увеличивает количество (предположительно) феромонов самок комнатной мухи, в результате чего усиленный химический сигнал воспринимается самцами как сверхнормальный стимул;
    2) E. muscae синтезирует новые химические соединения, которые обычно отсутствуют у самок домашних мух, а самцы реагируют на качественно новый, «улучшенный» сигнал для спаривания.

Исследователи начали с поведенческих экспериментов, в которых здоровым мухам предъявляли инфицированные и неинфицированные трупы. В качестве контроля использовали трупы здоровых мух, убитых замораживанием при −24°C. Все инфицированные мухи, трупы которых использовали в экспериментах, были убиты энтомофторой. При этом часть трупов использовали в экспериментах в течение 3–8 часов после смерти, а часть — через 25–30 часов после смерти, сохраняя до этого при повышенной влажности, чтобы избежать высыхания. Такие условия позволили экспериментаторам проверить реакцию здоровых мух на трупы с грибами на ранних и на поздних стадиях спорообразования.

Мертвых мух помещали в чашки Петри и фиксировали на дне вазелином. Живых здоровых самцов мух усыпляли, охлаждая при 5°C, после чего помещали в центр чашки Петри. Там насекомые просыпались и видели перед собой два трупа, а камера фиксировала в течение 40 минут их поведение. Половое поведение самцов идентифицировалось по описанным выше «брачным ударам». Было установлено, что самцы мух значительно чаще пытались спариваться с трупами мух, в которых энтомофтора находилась на поздних стадиях споруляции (26–28 часов после смерти хозяина), но распространение спор во внешнюю среду еще не произошло. При этом, как и в упоминавшейся работе L. Zurek et al., трупы инфицированных самок привлекали самцов гораздо больше, чем трупы самцов, павших жертвой энтомофторы. Интересно, что если перед самцом в чашке Петри оказывались два трупа самок — один инфицированный, а другой — нет, то он совершал «брачные удары» по отношению к обоим, но самка с грибком на поздних стадиях споруляции была гораздо привлекательнее: попыток спариться с ней было значительно больше. То есть, вероятно, трупы самок на поздних стадиях споруляции гриба выделяли какие-то химические вещества, усиливающие половое поведение здоровых самцов.

Чтобы подтвердить, действительно ли привлечение здоровых мух таким способом выгодно для распространения грибка, самцов, контактировавших с инфицированными трупами, содержали в течение 10 дней в индивидуальных клетках на молочно-сахарной диете, ежедневно проверяя у них признаки грибковой инфекции. В результате энтомофторой заразились 73% самцов, контактировавших с трупами на поздних стадиях споруляции гриба, и только 15% самцов, имевших дело с грибом на ранних стадиях образования спор. То есть энтомофторе «выгодно» привлекать потенциальных здоровых хозяев именно в тот момент, когда ее споры почти созрели и уже достаточно патогенны. Спаривание с трупом самки всегда длится намного меньше, чем нормальное спаривание у комнатных мух. Однако, по всей видимости, даже такого краткого контакта достаточно для передачи инфекции новому хозяину.

Во время поведенческих экспериментов ученые заметили, что самцы мух иногда подходят к свободнолежащим конидиям энтомофторы, вытягивают хоботки и пробуют споры на вкус. Тогда исследователи решили проверить: достаточно ли одних только конидиев для привлечения потенциальных хозяев гриба? Здоровым мухам предоставили возможность выбора между двумя липкими ловушками, установленными внутри клетки из плексигласа (рис. 5, слева). Ловушки были устроены так, что снаружи не было видно, что находится внутри. В одной ловушке лежали конидии E. muscae от трех трупов самцов или трех трупов самок мух, а другая была контролем и не содержала конидиев. Мух помещали в клетку на 24 часа, после чего оценивали количество мух, прилипших к каждой из ловушек. Оказалось, что здоровые мухи чаще попадались в ловушки с конидиями E. muscae, причем независимо от пола трупов-споропроизводителей.

Исследователи предположили, что привлекательность не только трупов с конидиями, но и самих конидиев может быть связана с какими-то летучими химическими соединениями. Они решили протестировать, как антенны самцов здоровых мух будут реагировать на летучие соединения рядом с живыми мухами, с неинфицированными трупами, со спорообразующими трупами и с конидиями, собранными во внешней среде после рассеивания. Пробы воздуха были собраны с помощью аэрации чашек Петри, содержащих по отдельности все эти потенциально привлекательные источники летучих соединений. Для измерения реакции антенн самцов домашней мухи на исследователи использовали электроантеннографию (см. Electroantennography).

Как оказалось, самцы особенно активно реагировали на поток воздуха от «чистых» конидиев и от трупа со споруляцией гриба. При этом реакция была намного сильнее, если трупы были на поздних стадиях образования грибных спор. Кроме того, неутомимые ученые провели поведенческие эксперименты с помещением мух в Y-образную трубу, где насекомое должно было выбирать между ответвлениями лабиринта с воздухом от инфицированного трупа и от здоровой мухи, гуманно убитой учеными (рис. 5, справа). Самцы выбирали воздух от трупа с энтомофторой и уверенно ползли в соответствующую часть трубки, что подтвердило результаты электроантеннографии: мухи действительно могут обнаруживать какие-то летучие вещества в трупах, инфицированных E. muscae.

Потом исследователи решили выяснить, а, собственно, какие же химические соединения делают инфицированные трупы такими притягательными для здоровых мух? Для этого были приготовлены гексановые экстракты неинфицированных трупов мух, а также трупов на ранних (3–8 часов после смерти) и поздних (26–28 часов после смерти) стадиях споруляции патогенного гриба. Полученные экстракты содержали кутикулярные соединения мух, а также метаболиты грибов, растворимые в гексане. Затем экстракты были проанализированы с помощью метода газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Оказалось, что химический состав инфицированных и неинфицированных трупов отличался. В трупах пораженных мух содержались длинноцепочечные спирты и эфиры, отсутствующие у здоровых, а некоторых общих для них компонентов в инфицированных трупах было больше (рис. 6). При этом содержание многих веществ (в том числе кутикулярных углеводородов) увеличивалось в трупах по мере спороношения гриба: на поздних стадиях его споруляции трупы хозяина содержали таких веществ гораздо больше, чем на ранних.

Интересно, что по результатам ГХ-МС уже упоминавшийся (Z)-9-трикозен вообще не был обнаружен в неинфицированных трупах мух, а в зараженных трупах он выявлялся только на поздних стадиях спороношения, да и то в следовых количествах. Так что, видимо, причина привлекательности трупов все же не в этом феромоне. Однако на поздних стадиях споруляции энтомофторы в трупах ее хозяев значительно увеличивалось содержание метил-разветвленных алканов, предварительно идентифицированных как 2-метилоктакозан, 2- и 4-метилтриаконтан, и 11- и 13-метилгептатриаконтан. Самое интересное, что ранее было обнаружено стимулирующее действие этих соединений на половое поведение самцов комнатной мухи: 2-метилоктакозан, неизвестный метил-разветвленный гептатриаконтан и 4-метилтриаконтан увеличивают у самцов количество попыток спаривания (T. S. Adams et al., 1995. Effect of methylalkanes on male house fly, Musca domestica, sexual behavior).

По-видимому, возрастающее количество кутикулярных углеводородов в трупах инфицированных самок стимулирует проявление полового поведения самцов по отношению к ним. Однако, эти соединения, вероятно, воспринимаются насекомыми все-таки на достаточно небольших расстояниях от источника. Поэтому исследователи вновь вернулись к мысли о том, что есть какие-то летучие соединения, воздушный шлейф которых может привлекать мух на дальних дистанциях.

Чтобы проверить это предположение, ученые использовали метод улавливания летучих соединений (headspace analysis): отбирались пробы воздуха, который в течение 22 часов пропускался через контейнеры с инфицированными и неинфицированными трупами самцов и самок, после чего сравнивали их химический состав все тем же методом ГХ-МС. Список летучих соединений от инфицированных и неинфицированных трупов мух заметно отличался, а вот от половой принадлежности погибшей от грибка мухи он не зависел. Вокруг инфицированных трупов обоих полов было обнаружено 24 летучих соединения (с преобладанием сесквитерпенов), в том числе этиловый эфир и этилоктаноат (ethyl octanoate).

Итак, химический состав кутикулы инфицированных трупов и набор летучих соединений в воздухе вокруг них отличался от соответствующих характеристик трупов здоровых мух. К тому же, как уже было сказано выше, антенны здоровых самцов активнее реагируют на воздух от зараженных трупов. Тогда исследователи решили определить, на какие именно химические соединения антенны самцов реагируют сильнее? Для этого снова был использован метод электроантеннографии, который показал, что согласованную активную реакцию антенн вызывают этилоктаноат (использовалось химически чистое, искусственно синтезированное вещество), два предполагаемых сесквитерпена и два соединения с неизвестной структурой.

При этом чистый этилоктаноат независимо от дозировки (в пределах 20–2000 нг) не вызывал абсолютно никакой поведенческой реакции у самцов домашней мухи при тестировании в Y-образной трубе. Так что, по-видимому, одного только этилоктаноата недостаточно, чтобы привлечь здоровых мух. Надо сказать, что недавно было обнаружено, что сесквитерпены привлекательны и для некоторых других насекомых. Например, β-кариофиллен и β-элемен привлекательны для Apis cerana (X.-M. Zhang, 2017. Floral volatile sesquiterpenes of Elsholtzia rugulosa (Lamiaceae) selectively attract Asian honey bees), а β-транс-бергамотин, как полагают, привлекает шмелей (A. I. Haber et al., 2018. A key floral scent component (β-trans-bergamotene) drives pollinator preferences independently of pollen rewards in seep monkeyflower).

Интересно, что здоровые самцы мух не предпринимали попыток спариваться с трупами, если вокруг последних уже был ореол из рассеянных конидиев. Есть данные, говорящие о том, что другие членистоногие (паутинные клещи) избегают трупов соплеменников, покрытых конидиями другого патогенного грибка, Neozygites floridana (N. Trandem et al., 2015. Fatal attraction: Male spider mites prefer females killed by the mite-pathogenic fungus Neozygites floridana). Вероятно, здоровых клещей «настораживают» тактильные сигналы от прикосновения к конидиям. Однако в случае с E. muscae, рассеявшиеся конидии не отпугивали мух, просто они не стимулировали половое поведение, а скорее вызывали исследовательский и пищевой интерес (об этом уже говорилось выше). Возможно, летучие соединения от трупов, воспринимаемые на большом расстоянии, вызывают у здоровых мух половое поведение, а на близком расстоянии или при контакте с конидиями оно может переключаться на пищевое. Подобный механизм недавно был предложен для объяснения того, как привлекает опылителей австралийская паучья орхидея (Caladenia drummondii), опыляемая самцами одиночных ос семейства Thynnidae (R. D. Phillips et al., 2021. Pollination by nectar-foraging pompilid wasps: a new specialized pollination strategy for the Australian flora).

Напоследок авторы решили ответить еще на один вопрос: а откуда же берутся в инфицированном трупе эти манящие самцов химические соединения, концентрация которых возрастает на поздних стадиях споруляции грибка? Синтезирует эти вещества сам патогенный грибок для привлечения потенциальных хозяев, или это, как вариант, результат посмертной экспрессии каких-то генов мухи? Для этого исследователи отсеквенировали транскриптомы неинфицированных трупов и трупов с энтомофорой на ранних и поздних стадиях споруляции гриба.

Результаты анализа транскриптомов показали, что в трупах мух активно экспрессировались гены энтомофторы. При этом, чем дальше заходила споруляция гриба, тем сильнее была экспрессия нескольких ключевых ферментов, катализирующих синтез предшественников биоактивных сложных эфиров и жирных кислот (например, ацетил-коА-карбоксилазы (ACC1), синтазы жирных кислот (FAS1, FAS2) и длинноцепочечной жирной ацил-CoA-лигазы 2 (ACSL)). Кроме того, в свежих и не очень трупах энтомофтора синтезировала все семь ферментов мевалонатного пути, вовлеченные в биосинтез сесквитерпеноидов и тритерпеноидов. И наконец, ученым удалось идентифицировать три экспрессируемых транскрипта гриба, экспрессия одного из которых значительно усиливалась на более поздних стадиях споруляции. Эти транскрипты были гомологичны дрожжевым (Saccharomyces erevisiae) генам, участвующим в биосинтезе этилоктаноата. Интересно, что при этом посмертная экспрессия мушиных генов биосинтеза алкенов значительно снижалась через 28 часов после смерти. То есть, похоже, что E. muscae несет единоличную ответственность за биосинтез и выделение в окружающую среду этилоктаноата и сесквитерпена. Всё это подтверждает гипотезу, согласно которой грибы сами синтезируют привлекательные для потенциальных хозяев вещества, а здоровые самцы комнатных мух реагируют на качественно улучшенный химический сигнал от инфицированных трупов.

Нужны ли эти соединения энтомофторе для каких-то других нужд помимо манипуляций поведением хозяев, пока остается загадкой. Возможно, эти вещества необходимы для нормальной жизнедеятельности грибка во время спороношения, или они помогают дольше сохранить труп хозяина и защищают его от агрессивной окружающей среды.

В любом случае, это явно далеко не последнее исследование взаимоотношений энтомофторы и ее хозяина. Комнатные мухи могут переносить более ста заболеваний, опасных для человека (F. Khamesipour et al., 2018. A systematic review of human pathogens carried by the housefly (Musca domestica L.)), а E. muscae вызывает массовые эпизоотии мух и может быть кандидатом на роль биологического агента в борьбе с этими насекомыми. Существенное ограничение в подобном применении мушиной энтомофторы — высокая чувствительность патогенного гриба к температуре воздуха. Инфицированные мухи могут специально перемещаться туда, где температура воздуха выше, что позволяет им избавиться от патогенного гриба (D. W. Watson et al., 1993. Behavioral Fever Response of Musca domestica (Diptera: Muscidae) to Infection by Entomophthora muscae (Zygomycetes: Entomophthorales)). Поэтому выделение и изучение веществ, потенциально способных привлекать мух на большом расстоянии, может стать важной вехой в разработке методов борьбы с этими насекомыми.

Источник: elementy.ru