Биологи обнаружили, что потеря основных светочувствительных клеток не лишает грызунов зрения. Оставшись без палочек и колбочек, мыши продолжили видеть.
Исследование ученых из университета Джона Хопкинса опубликовано в журнале Neuron. Для того, чтобы выяснить, как же мыши могут видеть без основных типов светочувствительных клеток и даже просто для того, чтобы выявить сам этот факт, специалистам пришлось применить комбинацию из самых современных и сложных методов исследования.
Слепые мутанты
Прежде всего ученым потребовалось получить мышь, которая была бы не просто слепой, а у которой бы не работали палочки и колбочки. Напомним, что палочки воспринимают яркость и имеют большую чувствительность, а колбочки разделяют цвета, но зато требуют больше света, эти два типа клеток используют разные типы родопсинов – веществ, реагирующих на свет.
Мыши, слепота которых была бы обусловлена иными причинами, не годились— и единственным способом получить требуемых животных была генная инженерия. Удаление генов Gnat1 и Gnat3, кодирующих особые ферменты, связанные с работой родопсина, дало требуемый эффект— и это была лишь малая часть работы.
Схема сетчатки глаза. Это не просто светочувствительная поверхность - поверх палочек и колбочек (соотношение между ними на рисунке искажено, реально различающих цвета колбочек в десять раз меньше палочек) расположено несколько слоев нервных клеток.
Проверка, проверка и еще раз проверка
Но мыши, у которых методами генной инженерии вывели из строя палочки и колбочки, все-таки что-то видели. Сразу возникает вопрос: где гарантия того, что специалисты по генной инженерии сделали свою работу именно так, как было заявлено? А может, мышей вовсе перепутали, привезли в лабораторию каких-нибудь других животных? Или, может, у молекулярных биологов были неверные представления о том, что же необходимо для работы палочек и колбочек?
Чтобы ответить на все эти вопросы (а им посвящена большая часть оригинальной статьи) биологи проследили связи между нервными клетками и клетками сетчатки.
Понять, насколько сложной была эта задача, поможет сравнение. Представьте себе клубок из десятков тысяч нитей, к концу каждой из которых привязаны пуговицы, и, вдобавок, сам клубок залит клеем так, что распутать его нельзя. И все же установить, какие пары пуговиц связаны одной ниткой— задача более простая, чем та, которую пришлось решать билологам, ведь пуговицы и нитки хотя бы видны невооруженным глазом!
Разноцветные "кусты" в нижней части снимка - это т.н. мшистые клетки, точнее их отростки. Потрясающая по своей красоте серия микрофотографий мозга была получена еще в 2007 году биологами из Гарвардского и Кмебриджского университетов, сумевших создать трансгенную мышь, каждый нейрон которой окрашивался в случайно выбранный цвет за счет комбинации трех флуоресцентных белков.
На помощь снова пришла генная инженерия. Исследователи специально заказали сразу несколько линий лабораторных мышей, включая мышей линии Brainbow— каждая нервная клетка которых синтезировала свою комбинацию флуоресцентных белков и тем самым окрашивалась в свой цвет. Это позволило отследить нервные связи между сетчаткой и мозгом... правда, снова с целым рядом дополнительных ухищрений.
Генетический конструктор
Итак, у ученых были «теоретически слепые» мыши с неработоспособными палочками и колбочками. Биологи в серии поведенческих тестов (например, в простых Y-образных лабиринтах) убедились что эти мыши все-таки видят, и на следующем этапе исследований надо было показать, чем именно видят мыши. Для этого требовалось проследить за нервными связями.
В распоряжении ученых есть микроскоп и еще одна серия мутантных животных, каждая клетка мозга которых (а также клетки сетчатки) сами красятся в нужный цвет. Что делать? Извлекать мозг с сетчаткой и зрительным нервом, класть под микроскоп и прослеживать отдельные нервы? Этот подход не сработает: аналогия с заклеенным мотком ниток не случайна, увидеть что-то в плотной структуре нервной ткани не получится.
Структура белка, необходимого для работы палочек и колбочек. Трехмерная реконструкция.
Для решения описанной головоломки снова пригодилась генная инженерия. Комбинируя свойства нескольких линий трансгенных животных, удалось создать мышь, клетки коротой окрашиваются в нужный цвет избирательно – то есть красится не все нейроны подряд, а только те, которые расположены в сетчатке и, более того, действительно реагируют на свет. Мешанина из десятков тысяч волокон превращается в намного более простую структуру и вот ее-то можно изучать под микроскопом.
Подтверждение догадки
Описав технические проблемы, стоявшие перед учеными и методы их решения, можно перейти и к изложению разгадки — как же именно мыши без палочек и колбочек видели нарисованные на стенах лабиринта фигуры.
Как удалось установить после кропотливого изучения связей между клетками (а заодно и электрофизиологической проверки, исследователи смогли поймать электрические импульсы клеток), роль палочек и колбочек отчасти берут на себя светочувствительные клетки иного типа.
Способность клеток типа ipRGC, они же фоточувствительные ганглиозные клетки сетчатки, воспринимать свет была открыта в 1990-х годах, но со зрением тогда это не связали, решив, что их число слишком уж мало для полноценного участия в формировании картинки. Роль этих клеток сводили к общей реакции на свет на уровне циклов сна и бодрствования— и, как выяснилось сейчас, совершенно зря.
Детальное исследование нескольких подтипов этих клеток достаточно убедительно свидетельствует в пользу того, что они могут формировать пусть очень низкого качества, но все-таки изображение. ТАк что, если палочки с колбочками не работают, то это еще не означает слепоту.
Оправданная жестокость
В завершении рассказа стоит упомянуть одну деталь, которая обычно не афишируется учеными, а у некоторых далеких от науки людей вызывает крайне неоднозначные эмоции. В разделе «Методы», который есть в каждой научной статье, упоминается, что на определенном этапе, когда требовалось показать, что выбранная учеными система клеточных меток действительно работает, мышей ослепляли окончательно. Под общим наркозом грызунам удалили глаза, после чего еще три недели животные жили вслепую, через три недели ослепления никаких меток их нейроны уже не содержали.
Жестоко? Согласно принятым нормам— да, такие опыты никто не даст делать просто так, на них требуется специальное разрешение, выдаваемое лишь при обосновании совершаемых манипуляций. И обоснование в данном случае было весьма веским: некоторое число ослепленных мышей позволило доказать то, что вся сложная и кропотливая работа проделана корректно, ее результаты заслуживают внимания. В том числе и внимания врачей, ищущих способы преодоления слепоты.
Ожоги и переломы
Другой пример жестких экспериментов: изучение влияния одиночества на скорость выздоровления после ожогов и проверка эффективности стволовых клеток в лечении переломов. Переломы и ожоги у крыс для этого пришлось сначала создать— естественно, снова под наркозом.
По словам Самера Хаттара, одного из проведших серию экспериментов ученых, сейчас есть надежда на то, что хотя бы малая часть практически слепых людей сможет развить способность использовать свои ipRGC-клетки. Для самых простых действий, где не требуется высокая острота зрения, этого могло бы быть достаточно.
